Cystic Fibrosis Air3Gel

English

Product Description

Reproducible and high-throughput in vitro models are essential for studying complex microbial communities. This kit is designed for the in vitro modeling of human disease-specific airway mucus. Cystic Fibrosis Air³Gel is presented here as a platform for culturing microbial samples. The protocol describes how to culture microbial samples in Cystic Fibrosis Air³Gel using a multi-well plate format and how to prepare the samples for downstream analyses. Downstream assays include cell viability assessment, flow cytometry, metabolomics, and sequencing. The potential applications of Cystic Fibrosis Air³Gel include microbial mining, drug screening, and permeability assays.

Components

• 2x multi-well plates containing gradient Cystic Fibrosis Air³Gel.

• 50 mL Bac³Gel® dissolution medium (200 mM sodium citrate).

Reagent Required But Not Provided

• 0.9% (w/v) NaCl solution prepared in deionized water.

Storage Conditions

Store in a dry place inside tightly sealed containers at 2-8 °C.

This product can be stored for at least 9 months.

Precautions and Disclaimer

For R&D use only.

Procedure

Before you begin

• The protocol below describes the specific steps for using single strain samples. However, this protocol has also been used to culture co-cultures, microbial consortia, and complex microbial communities. The Cystic Fibrosis Air³Gel used in this protocol can be produced in Mueller Hinton (MH) medium and is composed of 25.0 mg.mL^-1 porcine stomach type III mucin and 16.3 mg.mL^-1 NaCl. Cystic Fibrosis Air³Gel’s composition is fully tunable; customized compositions are commercially available (i.e. incorporation of other mucin types, proteins, lipids and media). The cross-linking and oxygen gradients within Cystic Fibrosis Air³Gel are intrinsic features established during the production process. These are dynamically affected by microbial culturing.

• Ensure all instruments and consumables (pipettes, falcons, and microcentrifuge tubes) are sterilized and free of contaminants.

• All manipulations should be performed under aseptic conditions, ideally in a Class II biological safety cabinet.

• Prepare a 0.9% (w/v) sterile NaCl solution.

A. Preparation of Microbial Suspensions

Timing: ~ 15 min

1. Grow cultures of the species of interest (e.g. Pseudomonas aeruginosa) to the logarithmic (log) growth phase in the appropriate medium.

• Centrifuge the cultures to pellet the cells, then discard the supernatant.

• Resuspend the cell pellet in an appropriate culture medium.

ImportantImportant

If Cystic Fibrosis Air³Gel was produced in culture medium, researchers should resuspend the cell pellet in 0.9 (w/v) NaCl instead of medium.

• Measure the optical density at 600 nm (OD₆₀₀) of the microbial suspension.

• Adjust the cell concentration as needed.

B. Culturing in Cystic Fibrosis Air³Gel

Timing: ~ 5 min per plate

1. Prepare Cystic Fibrosis Air³Gel multi-well plates at room temperature. For this protocol, 24-well plates are used as example.

2. Add the microbial suspension to each well in a 1:1 volume ratio with Cystic Fibrosis Air³Gel.

Example: For a 24-well plate, add 700 μL of microbial suspension as each well contains 700 μL of Cystic Fibrosis Air³Gel.

Volumes for other plate formats:

• 6-well: 3,700 μL
• 12-well: 1,600 μL
• 48-well: 350 μL
• 96-well: 100 μL

3. Cover the plates and incubate at 37 °C under aerobic or anaerobic conditions for up to 72 hours depending on experimental design.

NoteNote

The recommended incubation period is 72 hours but it may be adjusted as required by the user.

To test the effects of molecules (e.g. biotics, active principles) on microbial samples, it is recommended to let the microbes stabilize in Cystic Fibrosis Air³Gel for 24 hours at 37 °C before adding the molecule of interest.

TipOptional

The multi-well plates can be sealed with a breathable sealing membrane prior to incubation to prevent cross-contamination.

WarningCRITICAL

The microbial suspension should be added gently (to avoid cross-contamination) to the top of Cystic Fibrosis Air³Gel. Do not mix.

While not a strict requirement, ensuring anaerobic conditions prior culturing in Cystic Fibrosis Air³Gel will prevent the loss of obligate anaerobes.

C. Dissolution of Cystic Fibrosis Air³Gel

Timing: ~ 3 min per well

1. For each well, remove the supernatant from the surface of Cystic Fibrosis Air³Gel by gentle aspiration, without disturbing the gel.

• Wash the gels by adding 700 μL (for 24-well plates) of 0.9% NaCl solution.

• Gently aspirate and discard the supernatant.

NoteNote

The washing step ensures that we only consider microbes colonizing Cystic Fibrosis Air³Gel.

2. Add Bac³Gel® dissolution medium (50 mM sodium citrate solution) to each well. Mix thoroughly to fully dissolve Cystic Fibrosis Air³Gel structure.

• To calculate the volume of Bac³Gel® dissolution medium to add to each well, enter the volume (μL) of Cystic Fibrosis Air³Gel according to the multi-well plate typology and click Calculate:

• Transfer the homogenized samples to microcentrifuge tubes.

NoteNote

Full dissolution of Cystic Fibrosis Air³Gel can take some time depending on the plate format and on the presence of exopolysaccharides.

For sequencing: Centrifuge the samples (14,000 x g, 10 minutes), then use the pellet for DNA extraction.

For metabolomics: Centrifuge the samples (14,000 x g, 10 minutes), then collect and lyophilize the supernatant.

Other applications include assessing cell viability, performing flow cytometry analysis, measuring metabolic activity, and conducting standard microbiological characterization assays.

Troubleshooting

Problem 1

The gels are not dissolving properly or take too long to dissolve.

Potential solution

Solution 1: Increase the volume of 50 mM sodium citrate and mix.

日本語

製品概要

再現性が高く、ハイスループットに対応した in vitro モデルは、複雑な微生物コミュニティの研究に不可欠です。本キットは、疾患特異的なヒト気道粘液の in vitro モデリングを目的として設計されています。微生物培養のプラットフォームとして Cystic Fibrosis Air³Gel を提供します。

本プロトコールでは、マルチウェルプレート形式を用いて Cystic Fibrosis Air³Gel 内で微生物試料を培養する方法と、下流解析のための試料調製方法を説明します。下流解析には、細胞生存率評価、フローサイトメトリー、メタボロミクス解析、シーケンシングが含まれます。

Cystic Fibrosis Air³Gel の潜在的応用には、微生物探索、創薬スクリーニング、透過性アッセイなどがあります。

構成品

• Cystic Fibrosis Air³Gel（勾配構造）を含むマルチウェルプレート × 2 枚

• Bac³Gel® 溶解用培地 50 mL（200 mM クエン酸ナトリウム溶液）

付属していないが必要な試薬

• 脱イオン水で調製した 0.9%（w/v）NaCl 溶液

保管条件

密閉容器に入れ、乾燥した環境下で 2～8 ℃ にて保管してください。

本製品は、少なくとも 9 か月間保管可能です。

注意事項および免責事項

本製品は 研究開発（R&D）用途に限定して使用してください。

手順

実験開始前に

• 以下のプロトコールは、単一菌株試料の使用を想定した具体的手順を示していますが、共培養、微生物コンソーシアム、複雑な微生物コミュニティの培養にも使用されています。 本プロトコールで使用する Cystic Fibrosis Air³Gel は、Mueller Hinton（MH）培地中で製造可能であり、25.0 mg/mL の豚胃由来タイプ III ムチンおよび 16.3 mg/mL NaCl から構成されています。 Cystic Fibrosis Air³Gel の組成は完全にカスタマイズ可能で、市販のカスタム品も利用可能です（例：他のムチン、タンパク質、脂質、培地の組み込みなど）。 また、ゲル内部の架橋構造および酸素勾配は製造工程中に形成される固有の特性であり、微生物培養によって動的に影響を受けます。

• すべての器具・消耗品（ピペット、ファルコンチューブ、マイクロチューブなど）が滅菌済みで、汚染されていないことを確認してください。

• すべての操作は無菌条件下で行い、可能であれば クラス II バイオセーフティキャビネット内で実施してください。

• 0.9%（w/v）滅菌 NaCl 溶液を準備してください。

A. 微生物懸濁液の調製

所要時間：約 15 分

1. 対象微生物（例：Pseudomonas aeruginosa）を、適切な培地で対数増殖期（log 相）まで培養します。

• 培養液を遠心分離して細胞を沈降させ、上清を除去します。

• 細胞ペレットを適切な培養培地で再懸濁します。

Important重要

Cystic Fibrosis Air³Gel が培養培地中で製造されている場合、細胞ペレットは培地ではなく 0.9%（w/v）NaCl 溶液で再懸濁してください。

• 微生物懸濁液の 600 nm における光学密度（OD₆₀₀） を測定します。

• 必要に応じて細胞濃度を調整してください。

B. Cystic Fibrosis Air³Gel での培養

所要時間：約 1 プレートあたり 5 分

1. Cystic Fibrosis Air³Gel マルチウェルプレートを室温に戻します。本プロトコールでは 24 ウェルプレートを例として使用します。

2. 各ウェルに、Cystic Fibrosis Air³Gel と体積比 1:1となるように微生物懸濁液を添加します。

例：24 ウェルプレートでは、各ウェルに 700 µL の Cystic Fibrosis Air³Gel が含まれているため、700 µL の微生物懸濁液を添加します。

他のプレート形式での添加量：

• 6 ウェル：3,700 µL

• 12 ウェル：1,600 µL

• 48 ウェル：350 µL

• 96 ウェル：100 µL

3. プレートを覆い、実験デザインに応じて 37 ℃ で、好気条件または嫌気条件下にて最大 72 時間培養します。

Note注意

推奨培養時間は 72 時間ですが、必要に応じて調整可能です。

分子（例：バイオティクス、活性成分）が微生物に与える影響を評価する場合、目的分子を添加する前に、37 ℃で 24 時間、Cystic Fibrosis Air³Gel 内で微生物を安定化させることを推奨します。

Tip任意

培養前に、通気性シーリング膜でマルチウェルプレートを封止することで、交差汚染を防止できます。

Warning重要

微生物懸濁液は、Cystic Fibrosis Air³Gel の表面に静かに添加してください（交差汚染防止のため）。混合しないでください。

必須条件ではありませんが、培養前に嫌気条件を確保することで、偏性嫌気性菌の損失を防ぐことができます。

C. Cystic Fibrosis Air³Gel の溶解

所要時間：約 1 ウェルあたり 3 分

1. 各ウェルについて、ゲル構造を乱さないよう注意しながら、Cystic Fibrosis Air³Gel 表面の上清を穏やかに吸引除去します。

• 0.9% NaCl 溶液を 700 µL（24 ウェルプレートの場合）加えてゲルを洗浄します。

• 上清をやさしく吸引し、廃棄します。

Note注意

この洗浄工程により、Cystic Fibrosis Air³Gel に定着した微生物のみを解析対象とします。

2. 各ウェルに Bac³Gel® 溶解用培地（50 mM クエン酸ナトリウム溶液）を加え、Cystic Fibrosis Air³Gel が完全に溶解するまで十分に混合します。

• 各ウェルに添加する Bac³Gel® 溶解用培地の体積は、使用するマルチウェルプレートの種類に応じた Cystic Fibrosis Air³Gel の体積（µL）を入力し、「Calculate」 をクリックして算出してください。

• 均質化したサンプルをマイクロチューブに移します。

Note注意

Cystic Fibrosis Air³Gel の完全な溶解には、使用するプレート形式や菌体外多糖（exopolysaccharides）の存在により、時間を要する場合があります。

シーケンシング用：サンプルを遠心分離（14,000 × g、10 分）し、ペレットを DNA 抽出に使用します。

メタボロミクス用：サンプルを遠心分離（14,000 × g、10 分）し、上清を回収して凍結乾燥します。

その他の応用として、細胞生存率評価、フローサイトメトリー解析、代謝活性測定、標準的な微生物学的特性評価アッセイなどがあります。

トラブルシューティング

問題 1

ゲルが適切に溶解しない、または溶解に時間がかかりすぎる。

考えられる対処法

対処法 1： 50 mM クエン酸ナトリウム溶液の添加量を増やし、十分に混合してください。