Product Description
Reproducible and high-throughput in vitro models are essential for studying complex microbial communities. This kit is designed for the in vitro modeling of human airway mucus. Physiologic Air3Gel is presented here as a platform for culturing microbial samples. The protocol describes how to culture microbial samples in Physiologic Air3Gel using a syringe format and how to prepare the samples for downstream analyses. Downstream assays include cell viability assessment, flow cytometry, metabolomics, and sequencing. The potential applications of Physiologic Air3Gel include microbial mining, drug screening, and permeability assays.
Product Page: https://www.bac3gel.com/category/air3gel
Components
3x syringes, each containing 5 mL Physiologic Air3Gel.
50 mL Bac3Gel® dissolution medium (200 mM sodium citrate).
Material/Reagent Required But Not Provided
Syringe connector.
0.9% (w/v) NaCl solution prepared in deionized water.
Any required culture medium.
Culture medium is only required if the acquired Physiologic Air3Gel was not produced in any requested culture medium.
Storage Conditions
Store in a dry place inside tightly sealed containers at 2-8 °C.
This product can be stored for at least 9 months.
Precautions and Disclaimer
For R&D use only.
Procedure
Before you begin
The protocols below describe the specific steps for culturing single strain samples. However, these protocols have also been used to culture co-cultures, microbial consortia, and complex microbial samples. The Physiologic Air3Gel used in these protocols is composed of 20.0 mg.mL-1 porcine stomach type III mucin and 4.78 mg.mL-1 NaCl, respectively. Physiologic Air3Gel’s composition is fully tunable; customized compositions are commercially available (i.e. incorporation of other mucin types, proteins, lipids and media).
Ensure all instruments and consumables (pipettes, falcons, syringes, syringe connector, and microcentrifuge tubes) are sterilized and free of contaminants.
All manipulations should be performed under aseptic conditions, ideally in a Class II biological safety cabinet.
Prepare a 0.9% (w/v) sterile NaCl solution.
A. Preparation of Microbial Suspensions
1. Grow cultures of the species of interest (e.g. Pseudomonas aeruginosa) to the logarithmic (log) growth phase in the appropriate medium (e.g. LB medium).
Centrifuge the cultures to pellet the cells, then discard the supernatant.
Resuspend the cell pellet in LB medium or an appropriate culture medium.
If Physiologic Air3Gel was produced in culture medium, researchers should resuspend the cell pellet in 0.9 (w/v) NaCl instead of medium.
Measure the optical density at 600 nm (OD600) of the microbial suspension.
Adjust the cell concentration as needed.
B. Culturing in Physiologic Air3Gel
1. Discard the first 2-3 drops of Physiologic Air3Gel by gently pressing the syringe plunger.
2. Using the double syringe mixing method, combine the microbial suspensions prepared in A. and Physiologic Air3Gel in a 1:1 volume ratio by mixing 6-7 times.
- Dispense the syringe contents into a 15 mL falcon tube. Using a positive displacement pipette distribute the sample in equal volumes into microcentrifuge tubes.
If a syringe connector is not available, follow steps 3 and 4 instead, otherwise skip to step 5 after completing this step.
3. Dispense Physiologic Air3Gel from the syringe into a sterile 15 mL falcon tube.
4. Using a positive displacement pipette, transfer 500 μL of Physiologic Air3Gel into a microcentrifuge tube.
- Add an equal volume (500 μL) of the microbial suspensions prepared in A. and homogenize the mixture by gently pipetting.
Instead of microcentrifuge tubes, researchers can use 24-well plates.
5. Incubate the microcentrifuge tubes/24-well plate at 37 °C for up to 72 hours under aerobic or anaerobic conditions, according to the experimental design.
C. Dissolution of Physiologic Air3Gel
1. Add Bac3Gel® dissolution medium (200 mM sodium citrate solution) in a 1:1 ratio to each sample. Mix thoroughly to fully dissolve Physiologic Air3Gel structure.
- The homogenized samples can be used for downstream assays.
For sequencing: Centrifuge the samples (14,000 x g, 5 minutes), then use the pellet for DNA extraction.
For metabolomics: Centrifuge the samples (14,000 x g, 10 minutes), then collect and lyophilize the supernatant.
For measuring metabolic activity or optical density: Centrifuge the samples (14,000 xg, 5 minutes), discard the supernatant, then resuspend in 0.9 (w/v) NaCl.
Other applications include assessing cell viability, performing flow cytometry analysis, and conducting standard microbiological characterization assays.
製品概要
再現性が高く、ハイスループットに対応した in vitro モデルは、複雑な微生物コミュニティの研究に不可欠です。本キットは、ヒト気道粘液の in vitro モデリングを目的として設計されています。微生物培養のプラットフォームとして Physiologic Air3Gel を提供します。
本プロトコールでは、Physiologic Air3Gel をシリンジ形式で用いた微生物培養方法と、下流解析のための試料調製方法を説明します。下流解析には、細胞生存率評価、フローサイトメトリー、メタボロミクス解析、シーケンシングが含まれます。
Physiologic Air3Gel の潜在的応用には、微生物探索、創薬スクリーニング、透過性アッセイなどがあります。
構成品
Physiologic Air3Gel 5 mL 充填シリンジ × 3 本
Bac3Gel® 溶解用培地 50 mL（200 mM クエン酸ナトリウム溶液）
付属していないが必要な材料・試薬
シリンジコネクター
脱イオン水で調製した 0.9%（w/v）NaCl 溶液
必要に応じた培養培地
重要事項
取得した Physiologic Air3Gel が、指定した培養培地中で製造されていない場合にのみ、培養培地が必要です。
保管条件
密閉容器に入れ、乾燥した環境下で 2～8 ℃ にて保管してください。 本製品は、少なくとも 9 か月間保管可能です。
注意事項および免責事項
本製品は 研究開発（R&D）用途に限定して使用してください。
手順
事前準備
以下のプロトコールは、単一株試料の培養手順を示していますが、共培養や微生物コンソーシアム、複雑な微生物試料の培養にも使用可能です。 本プロトコールで使用する Physiologic Air3Gel の組成は以下の通りです：
ムチン（豚胃タイプ III）：20.0 mg/mL
NaCl：4.78 mg/mL
組成はカスタマイズ可能で、市販のカスタム品も利用できます（他のムチン、タンパク質、脂質、培地などの組み込みが可能）。
すべての器具・消耗品（ピペット、ファルコンチューブ、シリンジ、シリンジコネクター、マイクロチューブ）が滅菌済みで、汚染されていないことを確認してください。
操作は無菌条件下で行い、可能であれば クラス II バイオセーフティキャビネット内で作業してください。
0.9%（w/v）滅菌 NaCl 溶液を用意してください。
A. 微生物懸濁液の調製
1. 対象微生物（例：Pseudomonas aeruginosa）を適切な培地（例：LB 培地）で 対数増殖期（log 相）まで培養します。
2. 培養液を遠心分離して細胞を沈降させ、上清を除去します。
3. 細胞ペレットを LB 培地または適切な培養培地で再懸濁します。
もし Physiologic Air3Gel が培養培地中で製造されている場合、細胞ペレットは培地ではなく 0.9%（w/v）NaCl 溶液で再懸濁してください。
4. 微生物懸濁液の 600 nm における光学密度（OD₆₀₀） を測定し、必要に応じて細胞濃度を調整します。
B. Physiologic Air3Gel での培養
1. シリンジのプランジャーを軽く押して、最初の 2～3 滴の Physiologic Air3Gel を破棄します。
2. 二重シリンジ混合法を用いて、手順 A で準備した微生物懸濁液と Physiologic Air3Gel を体積比 1:1で混合し、6～7 回往復して均一化します。
- シリンジ内容物を 15 mL ファルコンチューブに分注し、正の変位ピペットを用いてマイクロチューブに等分に分配します。
シリンジコネクターが使用できない場合は、次のステップ 3 および 4 を行ってください。可能な場合は、このステップ後にステップ 5 に進みます。
3. シリンジから Physiologic Air3Gel を滅菌済み 15 mL ファルコンチューブに分注します。
4. 正の変位ピペットを使用して、500 µL をマイクロチューブに移します。
- 手順 A. で調製した微生物懸濁液を同量（500 µL）加え、やさしくピペッティングして混合します。
マイクロチューブの代わりに、24 ウェルプレート を使用することも可能です。
5. マイクロチューブまたは 24 ウェルプレートを 37 ℃ で、実験デザインに応じて好気条件または嫌気条件下で最大 72 時間培養します。
C. Physiologic Air3Gel の溶解
1. 各サンプルに Bac3Gel® 溶解用培地（200 mM クエン酸ナトリウム溶液） を 1:1 の比率で加え、完全に溶解するまで十分に混合します。
- 均質化されたサンプルは下流解析に使用可能です。
シーケンシング用：サンプルを遠心分離（14,000 × g、5 分）し、ペレットを DNA 抽出に使用します。
メタボロミクス用：サンプルを遠心分離（14,000 × g、10 分）し、上清を回収して凍結乾燥します。
代謝活性や光学密度測定用：サンプルを遠心分離（14,000 × g、5 分）し、上清を除去後、0.9%（w/v）NaCl 溶液で再懸濁します。
その他の応用：細胞生存率評価、フローサイトメトリー解析、標準的な微生物学的特性評価アッセイなど。