Gradient Gut3Gel Colonic

English

Product Description

Reproducible and high-throughput in vitro models are essential for studying complex microbial communities. This kit is designed for the in vitro modeling of human colon mucus layers. Gut³Gel is presented here as a platform for culturing human microbiota samples. The protocol describes how to culture fecal samples in Gut³Gel using a multi-well plate format and how to prepare the samples for downstream analyses. Downstream assays include cell viability assessment, flow cytometry, metabolomics, and sequencing. The potential applications of Gut³Gel include microbial mining, drug screening, and permeability assays.

Components

• 2x multi-well plates containing gradient Gut³Gel colonic.

• 50 mL Bac³Gel® dissolution medium (50 mM sodium citrate).

Reagent Required But Not Provided

• 0.9% (w/v) NaCl solution prepared in deionized water.

Storage Conditions

Store in a dry place inside tightly sealed containers at 2-8 °C.

This product can be stored for at least 9 months.

Precautions and Disclaimer

For R&D use only.

Procedure

Before you begin

• The protocol below describes the specific steps for using fecal samples. However, this protocol has also been used to culture monocultures, co-cultures, and microbial consortia. The Gut³Gel used in this protocol was produced in Brain Hearth Infusion (BHI) medium and is composed of 50 mg.mL^-1 porcine stomach type III mucin. Gut³Gel’s composition is fully tunable; customized compositions are commercially available (i.e. incorporation of other mucin types, proteins, lipids and media). The cross-linking and oxygen gradients within Gut³Gel are intrinsic features established during the production process. These are dynamically affected by microbial culturing.

• Ensure all instruments and consumables (blender, colander, pipettes, falcons, and microcentrifuge tubes) are sterilized and free of contaminants.

• All manipulations should be performed under aseptic conditions, ideally in a Class II biological safety cabinet.

• Prepare a 0.9% (w/v) sterile NaCl solution.

A. Fecal Sample Processing

Timing: ~ 15 min

1. Weigh at least 30 g of fresh fecal sample and transfer to a sterilized blender.

• For each 30 g of fecal sample, add 150 mL of sterile 0.9% NaCl solution.

• Homogenize the mixture until a uniform slurry is obtained.

2. To remove large particulate matter, filter the slurry through a sterilized colander into a sterile container.

• Aliquot into 50 mL falcon tubes.

• Keep the filtered slurry on ice until use (do not exceed 1 hour).

TipOptional

Filtered slurry can be aliquoted, supplemented with glycerol (final concentration of 10% v/v) and stored at -80 °C for future experiments. This should be done as quickly as possible to preserve microbial diversity.

WarningCRITICAL

Fecal samples should be as fresh as possible; ideally, processing should start within 30 minutes from defecation time.

Rapid processing is crucial to maintain microbial viability.

Avoid excessive blending to prevent mechanical damage to microbes.

B. Culturing in Gut³Gel

Timing: ~ 5 min per plate

1. Prepare Gut³Gel multi-well plates at room temperature. For this protocol, 24-well plates are used as example.

2. Add fecal slurry to each well in a 1:1 volume ratio with Gut³Gel.

Example: For a 24-well plate, add 700 μL of fecal slurry as each well contains 700 μL of Gut³Gel.

Volumes for other plate formats:

• 6-well: 3,700 μL
• 12-well: 1,600 μL
• 48-well: 350 μL
• 96-well: 100 μL

3. Cover the plates and incubate at 37 °C under aerobic or anaerobic conditions for up to 72 hours depending on experimental design.

NoteNote

The recommended incubation period is 72 hours but it may be adjusted as required by the user.

To test the effects of molecules (e.g. biotics, active principles) on microbiota, it is recommended to let microbiota stabilize in Gut³Gel for 24 hours at 37 °C before adding the molecule of interest.

TipOptional

The multi-well plates can be sealed with a breathable sealing membrane prior to incubation to prevent cross-contamination.

WarningCRITICAL

The fecal slurry should be added gently (to avoid cross-contamination) to the top of Gut³Gel. Do not mix.

While not a strict requirement, ensuring anaerobic conditions prior culturing in Gut³Gel will prevent the loss of obligate anaerobes.

C. Dissolution of Gut³Gel

Timing: ~ 3 min per well

1. For each well, remove the supernatant from the surface of Gut³Gel by gentle aspiration, without disturbing the gel.

• Wash the gels by adding 700 μL (for 24-well plates) of 0.9% NaCl solution.

• Gently aspirate and discard the supernatant.

NoteNote

The washing step ensures that we only consider microbes colonizing Gut³Gel.

2. Add Bac³Gel® dissolution medium (50 mM sodium citrate solution) to each well. Mix thoroughly to fully dissolve Gut³Gel structure.

• To calculate the volume of Bac³Gel® dissolution medium to add to each well, enter the volume (μL) of Gut³Gel according to the multi-well plate typology and click Calculate:

• Transfer the homogenized samples to microcentrifuge tubes.

NoteNote

Full dissolution of Gut³Gel can take some time depending on the plate format and on the presence of exopolysaccharides.

For sequencing: Centrifuge the samples (14,000 x g, 10 minutes), then use the pellet for DNA extraction.

For metabolomics: Centrifuge the samples (14,000 x g, 10 minutes), then collect and lyophilize the supernatant.

Other applications include assessing cell viability, performing flow cytometry analysis, measuring metabolic activity, and conducting standard microbiological characterization assays.

Troubleshooting

Problem 1

The gels are not dissolving properly or take too long to dissolve.

Potential solution

Solution 1: Increase the volume of 50 mM sodium citrate and mix.

日本語

製品説明

再現性が高く、かつハイスループットな in vitro モデルは、複雑な微生物コミュニティを研究するうえで不可欠である。本キットは、ヒト結腸の粘液層を in vitro でモデル化することを目的として設計されている。Gut³Gel は、ヒトマイクロバイオータ試料を培養するためのプラットフォームとして本プロトコルで実証されている。本プロトコルでは、マルチウェルプレート形式を用いて糞便試料を Gut³Gel 内で培養する方法、および下流解析のための試料調製手順を記載する。下流アッセイには、細胞生存率評価、フローサイトメトリー、メタボロミクス解析、シーケンシングが含まれる。Gut³Gel の潜在的な応用例としては、微生物マイニング、ドラッグスクリーニング、ならびに透過性アッセイが挙げられる。

構成品

• 勾配型 Gut³Gel（結腸用） を含むマルチウェルプレート ×2

• Bac³Gel® 溶解培地（50 mM クエン酸ナトリウム）50 mL

別途必要な試薬（本キットには含まれません）

• 脱イオン水で調製した 0.9%（w/v）NaCl 溶液

保管条件

密閉容器に入れ、乾燥した場所で 2～25 °C にて保管してください。

本製品は、少なくとも 9 か月間保管可能です。

注意事項および免責事項

本製品は研究開発目的（R&D）のみに使用してください。

手順

開始前に

以下のプロトコルは糞便試料を使用する場合の具体的な手順を記載しているが、本プロトコルは単一培養（モノカルチャー）、共培養、ならびに微生物コンソーシアの培養にも使用されている。本プロトコルで使用した Gut³Gel は Brain Heart Infusion（BHI）培地中で製造され、50 mg·mL⁻¹ のブタ胃由来タイプIIIムチンから構成されている。Gut³Gel の組成は完全に調整可能であり、他のムチンタイプ、タンパク質、脂質、培地の組み込みなど、カスタマイズ組成が商業的に提供されている。Gut³Gel 内の架橋勾配および酸素勾配は、製造工程中に形成される固有の特性であり、微生物培養によって動的に変化する。

• 全ての器具および消耗品（ブレンダー、ざる、ピペット、ファルコンチューブ、マイクロチューブ）は滅菌され、汚染のない状態であることを確認してください。

• すべての操作は無菌条件下で行い、理想的にはクラスIIバイオセーフティキャビネット内で実施してください。

• 0.9%（w/v）の滅菌 NaCl 溶液を用意してください。

A. 糞便試料の処理

所要時間: 約 15 分

1. 新鮮な糞便試料を少なくとも 30 g 量り取り、滅菌済みのブレンダーに移す。

• 糞便 30 g ごとに、滅菌済み 0.9% (w/v) NaCl 溶液 150 mL を加える。

• 均一なスラリーが得られるまで混合する。

2. 大きな固形物を除去するため、スラリーを滅菌済みのざるで濾し、滅菌容器に移す。

• 50 mL ファルコンチューブに分注する。

• 使用まで濾過したスラリーを氷上で保持する（1時間を超えないこと）。

Tipオプション

濾過したスラリーは分注し、グリセロールを最終濃度 10%（v/v）で添加したうえで、将来の実験用に −80 °C で保存することができる。微生物の多様性を保持するため、できるだけ迅速に行う必要がある。

Warning重要

糞便試料はできるだけ新鮮なものを使用すること。理想的には、採取後 30 分以内に処理を開始する。

微生物の生存率を維持するため、迅速な処理が不可欠である。

微生物への機械的損傷を防ぐため、過度のブレンディングは避けること。

B. Gut³Gel での培養

所要時間: 約 1 プレートあたり 5 分

1. 室温で Gut³Gel マルチウェルプレートを準備する。本プロトコルでは 24 ウェルプレートを例として使用する。

2. 各ウェルに糞便スラリーを Gut³Gel と体積比 1:1 で加える。

例：24 ウェルプレートの場合、各ウェルに 700 µL の糞便スラリーを加える（各ウェルには 700 µL の Gut³Gel が含まれる）。

他のプレートフォーマットにおける体積：

• 6 ウェル：3,700 μL
• 12 ウェル：1,600 μL
• 48 ウェル：350 μL
• 96 ウェル：100 μL

3. プレートに蓋をし、実験デザインに応じて 37 °C で好気または嫌気条件下で最大 72 時間培養する。

Note注意

推奨培養期間は 72 時間であるが、ユーザーの実験目的に応じて調整可能である。

分子（例：プロバイオティクスや活性成分）がマイクロバイオータに与える影響を評価する場合、対象分子を添加する前に Gut³Gel 内で 37 °C、24 時間培養し、マイクロバイオータを安定化させることが推奨される。

Tipオプション

培養前にマルチウェルプレートを通気性シール膜で覆うことで、交差汚染を防ぐことができる。

Warning重要

糞便スラリーは Gut³Gel の上面に優しく加えること（交差汚染を避けるため）。混ぜないこと。

厳密な必須条件ではないが、培養前に Gut³Gel 内を嫌気条件にしておくと、絶対嫌気性菌の損失を防ぐことができる。

C. Gut³Gel の溶解

所要時間: 1 ウェルあたり約 3 分

1. 各ウェルについて、Gut³Gel を乱さないように注意しながら、上清を優しく吸引して除去する。

• 24 ウェルプレートの場合、0.9% NaCl 溶液 700 µL を加えてゲルを洗浄する。

• 上清を優しく吸引して廃棄する。

Note注意

洗浄ステップにより、Gut³Gel に定着している微生物のみを評価対象とすることができる。

2. 各ウェルに Bac³Gel® 溶解培地（50 mM クエン酸ナトリウム溶液）を加える。Gut³Gel の構造が完全に溶解するまで十分に混合する。

• 各ウェルに加える Bac³Gel® 溶解培地 の体積を計算するには、マルチウェルプレートの種類に応じた Gut³Gel の体積（µL）を入力し、Calculate をクリックする。

• 均質化した試料をマイクロチューブに移す。

Note注意

Gut³Gel の完全な溶解には、プレート形式や多糖類（エキソポリサッカライド）の有無により時間がかかる場合がある。

シーケンシングの場合：試料を遠心分離（14,000 x g、10 分）し、ペレットを用いて DNA を抽出する。

メタボロミクスの場合：試料を遠心分離（14,000 x g、10 分）し、上清を回収して凍結乾燥する。

その他の応用例として、細胞生存率の評価、フローサイトメトリー解析、代謝活性の測定、標準的な微生物学的特性評価アッセイの実施などがある。

トラブルシューティング

問題 1

ゲルが適切に溶解しない、または溶解に時間がかかる。

考えられる解決策

解決策 1: 50 mM クエン酸ナトリウム溶液の体積を増やし、十分に混合する。