Homogeneous Gut3Gel

English

Product Description

Reproducible and high-throughput in vitro models are essential for studying complex microbial communities. This kit is designed for the in vitro modeling of human intestinal mucus. Homogeneous Gut³Gel is presented here as a platform for culturing microbial samples. The protocol describes how to culture microbial samples in Homogeneous Gut³Gel using a syringe format and how to prepare the samples for downstream analyses. Downstream assays include cell viability assessment, flow cytometry, metabolomics, and sequencing. The potential applications of Homogeneous Gut³Gel include microbial mining, drug screening, and permeability assays.

Product Page: https://www.bac3gel.com/category/gut3gel

Components

• 3x syringes, each containing 5 mL Homogeneous Gut³Gel (Colon/Small Intestinal).

• 50 mL Bac³Gel® dissolution medium (200 mM sodium citrate).

Material/Reagent Required But Not Provided

• Syringe connector.

• 0.9% (w/v) NaCl solution prepared in deionized water.

• Any required culture medium.

ImportantImportant

Culture medium is only required if the acquired Homogeneous Gut³Gel was not produced in any requested culture medium.

Storage Conditions

Store in a dry place inside tightly sealed containers at 2-8 °C.

This product can be stored for at least 9 months.

Precautions and Disclaimer

For R&D use only.

Procedure

Before you begin

• The protocols below describe the specific steps for culturing single strain samples. However, these protocols have also been used to culture co-cultures, microbial consortia, and complex microbial samples. The Homogeneous Gut³Gel used in these protocols is composed of 28.6, or 14.2 mg.mL^-1 porcine stomach type III mucin for Colon, and Small Intestinal versions, respectively, and 0.57 or 3.51 mg.mL^-1 NaCl, respectively. Homogeneous Gut³Gel’s composition is fully tunable; customized compositions are commercially available (i.e. incorporation of other mucin types, proteins, lipids and media).

• Ensure all instruments and consumables (pipettes, falcons, syringes, syringe connector, and microcentrifuge tubes) are sterilized and free of contaminants.

• All manipulations should be performed under aseptic conditions, ideally in a Class II biological safety cabinet.

• Prepare a 0.9% (w/v) sterile NaCl solution.

A. Preparation of Microbial Suspensions

Timing: ~ 15 min

1. Grow cultures of the species of interest (e.g. Escherichia coli) to the logarithmic (log) growth phase in the appropriate medium (e.g LB medium).

• Centrifuge the cultures to pellet the cells, then discard the supernatant.

• Resuspend the cell pellet in an appropriate culture medium.

ImportantImportant

If Homogeneous Gut³Gel was produced in culture medium, researchers should resuspend the cell pellet in 0.9 (w/v) NaCl instead of medium.

• Measure the optical density at 600 nm (OD₆₀₀) of the microbial suspension.

• Adjust the cell concentration as needed.

B. Culturing in Homogeneous Gut³Gel

Timing: 5 minutes

1. Discard the first 2-3 drops of Homogeneous Gut³Gel by gently pressing the syringe plunger.

2. Using the double syringe mixing method, combine the microbial suspensions prepared in A. and Homogeneous Gut³Gel in a 1:1 volume ratio by mixing 6-7 times.

• Dispense the syringe contents into a 15 mL falcon tube. Using a positive displacement pipette distribute the sample in equal volumes into microcentrifuge tubes.

NoteNote

If a syringe connector is not available, follow steps 3 and 4 instead, otherwise skip to step 5 after completing this step.

3. Dispense Homogeneous Gut³Gel from the syringe into a sterile 15 mL falcon tube.

4. Using a positive displacement pipette, transfer 500 μL of Homogeneous Gut³Gel into microcentrifuge tubes.

NoteNote

Instead of microcentrifuge tubes, researchers can use 24-well plates.

• Add an equal volume (500 μL) of the microbial suspensions prepared in A. and homogenize the mixture by gently pipetting.

5. Incubate the microcentrifuge tubes/24-well plate at 37 °C for up to 72 hours under aerobic or anaerobic conditions, according to the experimental design.

C. Dissolution of Homogeneous Gut³Gel

Timing: ~ 5 min per syringe

1. Add Bac³Gel® dissolution medium (200 mM sodium citrate solution) in a 1:1 ratio to each sample. Mix thoroughly to fully dissolve Homogeneous Gut³Gel structure.

• The homogenized samples can be used for downstream assays.

NoteNote

For sequencing: Centrifuge the samples (14,000 x g, 5 minutes), then use the pellet for DNA extraction.

For metabolomics: Centrifuge the samples (14,000 x g, 10 minutes), then collect and lyophilize the supernatant.

For measuring metabolic activity or optical density: Centrifuge the samples (14,000 xg, 5 minutes), discard the supernatant, then resuspend in 0.9 (w/v) NaCl.

Other applications include assessing cell viability, performing flow cytometry analysis, and conducting standard microbiological characterization assays.

日本語

製品説明

再現性が高く、ハイスループットに対応した in vitro モデルは、複雑な微生物コミュニティを研究する上で不可欠です。本キットは、ヒト腸管粘液の in vitro モデリングを目的として設計されています。本書では、微生物試料の培養プラットフォームとして Homogeneous Gut³Gel を紹介します。 本プロトコールでは、シリンジ形式を用いて Homogeneous Gut³Gel 内で微生物試料を培養する方法、および下流解析に供するための試料調製方法について説明しています。下流解析には、細胞生存率評価、フローサイトメトリー、メタボロミクス解析、シーケンシングが含まれます。 Homogeneous Gut³Gel の潜在的な応用分野としては、微生物探索（microbial mining）、創薬スクリーニング、透過性評価アッセイなどが挙げられます。

製品ページ：https://www.bac3gel.com/category/gut3gel

構成品

• Homogeneous Gut³Gel（大腸／小腸）を各 5 mL 充填したシリンジ × 3 本

• Bac³Gel® 溶解用培地 50 mL（200 mM クエン酸ナトリウム）

付属していないが必要な材料・試薬

• シリンジコネクター

• 脱イオン水で調製した 0.9%（w/v）NaCl 溶液

• 必要に応じた培養培地

Important重要事項

• 取得した Homogeneous Gut³Gel が、指定した培養培地中で製造されていない場合にのみ、培養培地が必要となります。

手順

事前準備

以下のプロトコールは、単一株試料の培養手順を示しています。しかし、共培養（co-culture）や微生物コンソーシアム、複雑な微生物試料の培養にも応用されています。本プロトコールで使用する Homogeneous Gut³Gel は、大腸用と小腸用でそれぞれ以下の組成を持ちます：

• 大腸用：28.6 mg/mL 豚胃由来タイプ III ムチン、0.57 mg/mL NaCl

• 小腸用：14.2 mg/mL 豚胃由来タイプ III ムチン、3.51 mg/mL NaCl

Homogeneous Gut³Gel の組成は完全にカスタマイズ可能で、市販のカスタム品も利用可能です（例：他のムチン種類、タンパク質、脂質、培地の組み込みなど）。

• すべての器具・消耗品（ピペット、ファルコンチューブ、シリンジ、シリンジコネクター、マイクロチューブなど）が滅菌済みで、汚染されていないことを確認してください。

• すべての操作は無菌条件下で行い、可能であれば クラス II バイオセーフティキャビネット内で作業してください。

• 0.9%（w/v）滅菌 NaCl 溶液を用意してください。

A. 微生物懸濁液の調製

所要時間：約 15 分

1. 対象微生物（例：Escherichia coli）を適切な培地（例：LB 培地）で 対数増殖期（log 相) まで培養します。

• 培養液を遠心分離して細胞を沈降させ、上清を除去します。

• 得られた細胞ペレットを適切な培養培地で再懸濁します。

Important重要事項

もし Homogeneous Gut³Gel が培養培地中で製造されている場合、細胞ペレットは培地ではなく 0.9%（w/v）NaCl 溶液で再懸濁してください。

• 微生物懸濁液の600 nm における光学密度（OD₆₀₀）を測定します。

• 必要に応じて細胞濃度を調整してください。

B. Homogeneous Gut³Gel での培養

所要時間：約 5 分

1. シリンジのプランジャーを軽く押して、Homogeneous Gut³Gel の最初の 2～3 滴を破棄します。

2. 二重シリンジ混合法を用いて、手順 A. で調製した微生物懸濁液と Homogeneous Gut³Gel を体積比 1:1で混合し、6～7 回往復して混ぜ合わせます。

• シリンジの内容物を 15 mL ファルコンチューブに移します。その後、正の変位ピペットを使用して、サンプルを等分に分注してマイクロチューブに移します。

Note注意

シリンジコネクターが使用できない場合は、ステップ 3 および 4 を実施してください。 それ以外の場合は、このステップ完了後にステップ 5 に進んでください。

3. シリンジから Homogeneous Gut³Gel を滅菌済み 15 mL ファルコンチューブに分注します。

4. 正の変位ピペットを使用して、Homogeneous Gut³Gel を 500 µL ずつマイクロチューブに移します。

Note注意

マイクロチューブの代わりに、24ウェルプレート を使用することも可能です。

• 手順 A で調製した微生物懸濁液を同量（500 µL） 加え、やさしくピペッティングして混合します。

5. マイクロチューブまたは 24 ウェルプレートを 37 ℃ で、実験デザインに応じて好気条件または嫌気条件下で最大 72 時間培養します。

C. Homogeneous Gut³Gel の溶解

所要時間：約 1 シリンジあたり 5 分

1. 各サンプルに Bac³Gel® 溶解用培地（200 mM クエン酸ナトリウム溶液） を 1:1 の比率で加えます。Homogeneous Gut³Gel が完全に溶解するように十分に混合してください。

• 均質化されたサンプルは、下流解析に使用可能です。

Note注意

シーケンシング用：サンプルを遠心分離（14,000 × g、5 分）し、ペレットを DNA 抽出に使用します。

メタボロミクス用：サンプルを遠心分離（14,000 × g、10 分）し、上清を回収して凍結乾燥します。

代謝活性や光学密度の測定用：サンプルを遠心分離（14,000 × g、5 分）し、上清を除去した後、0.9%（w/v）NaCl 溶液で再懸濁します。

その他の応用例として、細胞生存率評価、フローサイトメトリー解析、標準的な微生物学的特性評価アッセイなどがあります。