Vag3Gel

English

Product Description

Reproducible and high-throughput in vitro models are essential for studying complex microbial communities. This kit is designed for the in vitro modeling of human cervicovaginal mucus. Vag³Gel is presented here as a platform for culturing human microbiota samples and single strains. The protocol describes how to culture cervicovaginal microbiota and single strain samples in Vag³Gel using a syringe format and how to prepare the samples for downstream analyses. Downstream assays include cell viability assessment, flow cytometry, metabolomics, and sequencing. The potential applications of Vag³Gel include microbial mining, drug screening, and permeability assays.

Product Page: https://www.bac3gel.com/category/vag3gel

Components

• 3x syringes, each containing 5 mL Vag³Gel (Ovulatory/Non-ovulatory/Pregnancy).

• 50 mL Bac³Gel® dissolution medium (200 mM sodium citrate).

Material/Reagent Required But Not Provided

• Syringe connector.

• 0.9% (w/v) NaCl solution prepared in deionized water.

• MRS (de Man, Rogosa, and Sharpe) medium.

ImportantImportant

MRS medium is only required if the acquired Vag³Gel was not produced in MRS.

Storage Conditions

Store in a dry place inside tightly sealed containers at 2-8 °C.

This product can be stored for at least 9 months.

Precautions and Disclaimer

For R&D use only.

Procedure

Before you begin

• The protocols below describe the specific steps for culturing cervicovaginal microbiota samples and single strain samples. However, these protocols have also been used to culture co-cultures, and microbial consortia. The Vag³Gel used in these protocols is composed of 2.5, 3.0, or 5.0 mg.mL^-1 porcine stomach type III mucin for Ovulatory, Non-ovulatory and Pregnancy versions, respectively, and 0.07 mg.mL^-1 NaCl or MRS medium. Vag³Gel’s composition is fully tunable; customized compositions are commercially available (i.e. incorporation of other mucin types, proteins, lipids and media).

• Ensure all instruments and consumables (menstrual cup, pipettes, falcons, syringes, syringe connector, and microcentrifuge tubes) are sterilized and free of contaminants.

• All manipulations should be performed under aseptic conditions, ideally in a Class II biological safety cabinet.

• Prepare a 0.9% (w/v) sterile NaCl solution.

• Vag³Gel largely favors facultative anaerobes when incubated under aerobic conditions. Its use is especially recommended for culturing Lactobacillaceae.

Select a protocol:

– Select a protocol – Microbiota culturing Single strain culturing

A. Cervicovaginal Sample Isolation and Processing

Timing: ~ 75 min

1. The donor should use a menstrual cup for 60 minutes.

NoteNote

The menstrual cup must be handled exclusively with gloves. Gloves should be cleaned with a 70% ethanol wipe before handling the menstrual cup.

• After use, recover the menstrual cup and transfer it into a sterile 50 mL Falcon tube.

2. Centrifuge the Falcon tube containing the menstrual cup and its contents at 8,000 xg for 15 minutes to collect the secretions.

• Discard the menstrual cup after centrifugation.

• Resuspend the recovered sample in up to 100 mL of sterile MRS medium within a sterile Schott flask.

ImportantImportant

If Vag³Gel was produced in MRS, researchers should resuspend the recovered sample in 0.9 (w/v) NaCl instead of MRS medium.

• Homogenize the suspension by gently inverting the flask several times and pipetting up and down.

WarningCRITICAL

Cervicovaginal samples should be as fresh as possible; ideally, processing should start within 30 minutes from collection time and kept on ice.

Unused cervicovaginal samples can be aliquoted, supplemented with glycerol (final concentration of 10% v/v), and stored at -80 °C for future experiments. This should be done as quickly as possible to preserve microbial diversity.

B. Culturing in Vag³Gel

Timing: ~ 5 minutes

1. Remove the syringe cap and keep it sterile.

2. Discard the first 2-3 drops of Vag³Gel by gently pressing the syringe plunger.

3. Using the double syringe mixing method, combine the inoculum and Vag³Gel in a 1:1 volume ratio by mixing 6-7 times.

4. Insert the cap back into the syringe containing the inoculum + Vag³Gel.

5. Incubate the syringe at 37 °C for up to 72 hours under aerobic conditions, according to the experimental design.

NoteNote

The recommended incubation period is 72 hours but it may be adjusted as required by the user.

To test the effects of molecules (e.g. biotics, active principles) on microbiota, it is recommended to let microbiota stabilize in Vag³Gel for 24 hours at 37 °C before adding the molecule of interest using the double syringe mixing method.

WarningCRITICAL

While not a strict requirement, ensuring anaerobic conditions prior culturing in Vag³Gel will prevent the loss of obligate anaerobes.

C. Dissolution of Vag³Gel

Timing: ~ 5 min per syringe

1. Add Bac³Gel® dissolution medium (200 mM sodium citrate solution) in a 1:1 ratio to each sample. Mix thoroughly to fully dissolve Vag³Gel structure.

• The homogenized samples can be used for downstream assays.

NoteNote

For sequencing: Centrifuge the samples (14,000 x g, 5 minutes), then use the pellet for DNA extraction.

For metabolomics: Centrifuge the samples (14,000 x g, 10 minutes), then collect and lyophilize the supernatant.

For measuring metabolic activity or optical density: Centrifuge the samples (14,000 xg, 5 minutes), discard the supernatant, then resuspend in 0.9 (w/v) NaCl.

Other applications include assessing cell viability, performing flow cytometry analysis, and conducting standard microbiological characterization assays.

A. Preparation of Microbial Suspensions

Timing: ~ 15 min

1. Grow cultures of the species of interest (e.g. Lactobacillus) to the logarithmic (log) growth phase in the appropriate medium.

• Centrifuge the cultures to pellet the cells, then discard the supernatant.

• Resuspend the cell pellet in an appropriate culture medium.

ImportantImportant

If Vag³Gel was produced in MRS, researchers should resuspend the cell pellet in 0.9 (w/v) NaCl instead of MRS medium.

• Measure the optical density at 600 nm (OD₆₀₀) of the microbial suspension.

• Adjust the cell concentration as needed.

B. Culturing in Vag³Gel

Timing: 5 minutes

1. Discard the first 2-3 drops of Vag³Gel by gently pressing the syringe plunger.

2. Using the double syringe mixing method, combine the inoculum and Vag³Gel in a 1:1 volume ratio by mixing 6-7 times.

• Dispense the syringe contents into a 15 mL falcon tube. Using a positive displacement pipette distribute the sample in equal volumes into microcentrifuge tubes.

NoteNote

If a syringe connector is not available, follow steps 3 and 4 instead, otherwise skip to step 5 after completing this step.

3. Dispense Vag³Gel from the syringe into a sterile 15 mL falcon tube.

4. Using a positive displacement pipette, transfer 500 μL of Vag³Gel into microcentrifuge tubes.

• Add an equal volume (500 μL) of the microbial suspensions prepared in A. and homogenize the mixture by gently pipetting.

NoteNote

Instead of microcentrifuge tubes, researchers can use 24-well plates.

5. Incubate the microcentrifuge tubes/24-well plate at 37 °C for up to 72 hours under aerobic or anaerobic conditions, according to the experimental design.

日本語

製品概要

再現性が高く、ハイスループットに対応した in vitro モデルは、複雑な微生物コミュニティの研究に不可欠です。本キットは、ヒト子宮頸膣粘液の in vitro モデリングを目的として設計されています。Vag³Gel は、ヒトマイクロバイオータ試料および単一菌株を培養するためのプラットフォームとして提供されます。

本プロトコールでは、シリンジ形式を用いて Vag³Gel 内で子宮頸膣マイクロバイオータおよび単一菌株試料を培養する方法と、下流解析に向けた試料調製方法を説明します。下流解析には、細胞生存率評価、フローサイトメトリー、メタボロミクス解析、シーケンシングが含まれます。

Vag³Gel の潜在的応用には、微生物探索、創薬スクリーニング、透過性アッセイなどがあります。

製品ページ： https://www.bac3gel.com/category/vag3gel

構成品

• Vag³Gel（排卵期／非排卵期／妊娠期）各 5 mL 入りシリンジ × 3 本

• Bac³Gel® 溶解用培地 50 mL（200 mM クエン酸ナトリウム溶液）

付属していないが必要な器材・試薬

• シリンジコネクター

• 脱イオン水で調製した 0.9%（w/v）NaCl 溶液

• MRS 培地（de Man, Rogosa, Sharpe 培地）

Important重要

取得した Vag³Gel が MRS 培地中で製造されていない場合にのみ、MRS 培地が必要です。

保管条件

密閉容器に入れ、乾燥した環境下で 2～8 ℃ にて保管してください。

本製品は、少なくとも 9 か月間保管可能です。

注意事項および免責事項

本製品は 研究開発（R&D）用途に限定して使用してください。

手順

実験開始前に

• 以下のプロトコールは、子宮頸膣マイクロバイオータ試料および単一菌株試料の培養における具体的手順を示していますが、共培養や微生物コンソーシアムの培養にも使用されています。 本プロトコールで使用される Vag³Gel は、

  • 排卵期用：2.5 mg/mL

  • 非排卵期用：3.0 mg/mL

  • 妊娠期用：5.0 mg/mL

の豚胃由来タイプ III ムチンを含み、0.07 mg/mL NaCl または MRS 培地中で調製されています。 Vag³Gel の組成は完全にカスタマイズ可能で、他のムチン、タンパク質、脂質、培地を組み込んだカスタム製品も市販されています。

• 使用するすべての器具・消耗品（メンストラルカップ、ピペット、ファルコンチューブ、シリンジ、シリンジコネクター、マイクロチューブ）が滅菌済みで、汚染されていないことを確認してください。

• すべての操作は無菌条件下で行い、可能であれば クラス II バイオセーフティキャビネット内で実施してください。

• 0.9%（w/v）滅菌 NaCl 溶液を準備してください。

• Vag³Gel は、好気条件下では通性嫌気性菌の増殖を強く促進します。特に Lactobacillaceae の培養に適しています。

プロトコールを選択してください：

– プロトコールを選択してください – 微生物叢の培養 単一菌株の培養

A. 子宮頸膣サンプルの分離および前処理

所要時間：約75分

1. ドナーは月経カップを 60 分間 使用します。

Note注記

月経カップは必ず手袋を着用して取り扱ってください。 月経カップを扱う前に、手袋は 70% エタノールワイプで清拭する必要があります。

• 使用後、月経カップを回収し、滅菌済み 50 mL Falcon チューブに移します。

2. 月経カップおよび内容物を含む Falcon チューブを 8,000 × g、15 分間 遠心分離し、分泌物を回収します。

• 遠心分離後、月経カップを廃棄します。

• 回収したサンプルを、滅菌済み Schott フラスコ内で 最大 100 mL の滅菌 MRS 培地に再懸濁します。

Important重要

Vag³Gel が MRS 培地で製造されている場合、研究者は回収したサンプルを MRS 培地ではなく 0.9%（w/v）NaCl 溶液に再懸濁してください。

• フラスコを数回静かに反転させ、さらにピペッティングにより懸濁液を均一化します。

Warning重要

子宮頸膣サンプルは可能な限り新鮮な状態で使用してください。理想的には、採取後 30 分以内に処理を開始し、氷上で保持する必要があります。

未使用の子宮頸膣サンプルは分注し、最終濃度 10%（v/v）となるようグリセロールを添加した後、−80 °Cで保存することで将来の実験に使用できます。微生物多様性を保持するため、この操作はできるだけ迅速に行ってください。

B. Vag³Gel における培養

所要時間：約5分

1. シリンジキャップを外し、無菌状態を保ったまま保管します。

2. シリンジプランジャーを静かに押し、Vag³Gel の最初の 2～3 滴を廃棄します。

3. ダブルシリンジ混合法を用いて、接種液と Vag³Gel を 1:1 の体積比で 6～7 回混合します。

4. 接種液＋Vag³Gel を含むシリンジにキャップを再度装着します。

5. 実験計画に従い、好気条件下で 37 °C、最大 72 時間シリンジをインキュベートします。

Note注記

推奨されるインキュベーション時間は 72 時間ですが、ユーザーの要件に応じて調整可能です。

分子（例：バイオティクス、活性成分）が微生物叢に与える影響を評価する場合、対象分子をダブルシリンジ混合法で添加する前に、Vag³Gel 内で 37 °C、24 時間微生物叢を安定化させることが推奨されます。

Warning重要

必須条件ではありませんが、Vag³Gel での培養前に嫌気条件を確保することで、偏性嫌気性菌の損失を防ぐことができます。

C. Vag³Gel の溶解

所要時間：シリンジ 1 本あたり約 5 分

1. 各サンプルに対して、Bac³Gel® 溶解培地（200 mM クエン酸ナトリウム溶液）を 1:1 の体積比で添加します。 Vag³Gel の構造が完全に溶解するまで十分に混合してください。

• 均質化したサンプルは、下流解析に使用できます。

Note注記

シーケンシング用：サンプルを 14,000 × g、5 分遠心分離し、ペレットを DNA 抽出に使用します。

メタボロミクス用：サンプルを 14,000 × g、10 分遠心分離し、上清を回収して凍結乾燥します。

代謝活性または光学密度測定用：サンプルを 14,000 × g、5 分遠心分離し、上清を除去後、0.9%（w/v）NaCl 溶液で再懸濁します。

その他の応用として、細胞生存率評価、フローサイトメトリー解析、標準的な微生物学的特性評価アッセイなどがあります。

A. 微生物懸濁液の調製

所要時間：約15分

1. 対象とする菌種（例：Lactobacillus）を、適切な培地中で対数増殖期（log 期）まで培養します。

• 培養液を遠心分離して細胞をペレット化し、上清を廃棄します。

• 細胞ペレットを適切な培地に再懸濁します。

Important重要

Vag³Gel が MRS 培地で製造されている場合、研究者は細胞ペレットを MRS 培地ではなく 0.9%（w/v）NaCl 溶液に再懸濁してください。

• 微生物懸濁液の 600 nm における光学濃度（OD₆₀₀）を測定します。

• 必要に応じて細胞濃度を調整します。

B. Vag³Gel における培養

所要時間：5分

1. シリンジプランジャーを静かに押し、Vag³Gel の最初の 2～3 滴を廃棄します。

2. ダブルシリンジ混合法を用いて、接種液と Vag³Gel を 1:1 の体積比で 6～7 回混合します。

• シリンジ内容物を 15 mL Falcon チューブに分注します。

• 正容量ピペットを用いて、サンプルを等量ずつマイクロチューブに分注します。

Note注記

シリンジコネクターが利用できない場合は、ステップ 3 および 4を実施してください。利用可能な場合は、本ステップ完了後に ステップ 5へ進んでください。

3. シリンジから Vag³Gel を滅菌済み 15 mL Falcon チューブに分注します。

4. 正容量ピペットを用いて、500 µL の Vag³Gel をマイクロチューブに分注します。

• A. で調製した微生物懸濁液を 同体積（500 µL）加え、穏やかにピペッティングして均一化します。

Note注記

マイクロチューブの代わりに、24 ウェルプレートを使用することも可能です。

5. 実験計画に従い、マイクロチューブまたは 24 ウェルプレートを 37 °Cで、好気条件または嫌気条件下において 最大 72 時間インキュベートします。